If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Bağlandığınız bilgisayar bir web filtresi kullanıyorsa, *.kastatic.org ve *.kasandbox.org adreslerinin engellerini kaldırmayı unutmayın.

Ana içerik

Konu: AP®︎/Üniversite Biyoloji > Ünite 6

Ders 7: Biyoteknoloji
Fen
AP®︎/Üniversite Biyoloji
Gen İfadesi ve Regülasyonu
Biyoteknoloji
© 2024 Khan AcademyKullanım ŞartlarıGizlilik PolitikasıÇerez Politikası

Genel Bakış: DNA'nın Klonlanması

Google Classroom
DNA'nın klonlanmasının ne anlama geldiği, amacı ve temel adımları.

Önemli noktalar:

  • DNA'nın klonlanması bir gen gibi herhangi bir DNA parçasından, birbirinin aynısı kopyalar elde edilmesini sağlayan moleküler ve biyoloji tekniğidir.
  • Tipik bir klonlama deneyinde, hedef bir gen, plazmid adı verilen, dairesel bir DNA parçasının içine yerleştirilir.
  • Plazmid, transformasyon adı verilen bir süreçle bakterile aktarılır ve plazmidi taşıyan bakteriler antibiyotik kullanımı ile belirlenir.
  • Doğru plazmide sahip bakteriler, daha fazla plazmid DNA yapılması ya da bazı durumlarda ifadesi sonucu protein elde edilmesi için kullanılır.

Giriş

"Klonlama" kelimesini duyduğunuzda, aklınıza Koyun Dolly örneğinde olduğu gibi, bir organizmanın tamamının klonlanması gelmiş olabilir. Ancak, bir şeyi klonlamak, o şeyin genetik anlamda birebir bir kopyasını yapmak demektir. Bir moleküler biyoloji laboratuvarında en çok klonlanan şey, bir gen ya da DNA'nın küçük bir parçasıdır.
Moleküler biyolog bir arkadaşınız, "klonlama" işleminin pek de başarılı olmadığını söylüyorsa, muhtemelen yeni bir Dolly'nin peşinde değil, bazı DNA parçaları ile çalışıyordur!

DNA klonlamaya genel bakış

DNA'nın klonlanması, belirli bir DNA parçasının birden fazla ve tıpatıp aynısı olan kopyalarının yapılması sürecidir. Tipik bir DNA klonlanma prosedüründe, örneğin bir insan proteini açısından medikal öneme sahip bir gen ya da ilgilenilen DNA fragmanı, ilk olarak plazmid adı verilen dairesel bir DNA parçasına yerleştirilir. Yerleştirme işlemi, DNA'yı "kesip yapıştıran" enzimler tarafından yapılır ve ortaya farklı kaynaklardan gelen fragmanların birleşimi ile oluşmuş, rekombinant DNA adı verilen bir molekül çıkar.
Rekombinant bir DNA molekülünün yapımını gösteren şema. Plazmid DNA'sının dairesel bir parçasının ucunda bulunan çıkıntılar, gen fragmanınınkilerle uyuşuyor. Plazmid ve gen fragmanı, gen içeren bir plazmid oluşturmak için bir araya geliyor. Bu gen içeren plazmid, rekombinant DNA'ya ya da farklı kaynaklardan gelen DNA'lar ile oluşturulmuş bir DNA molekülüne verilebilecek örneklerden biridir.
Sonrasında, rekombinant plazmid, içinde bakteri bulunan bir ortama konur. Plazmidi taşıyan bakteriler seçilir ve yetiştirilir. Bakteriler üredikçe, plazmidi replike ederler, yavrularına aktarırlar ve böylece içerdiği DNA'nın bir sürü kopyası elde edilmiş olur.
Bir DNA dizisinin plazmid kullanılarak bir sürü kopyasının yapılmasının ne gibi bir amacı olabilir? Bazı durumlarda, deney yapabilmek ya da yeni plazmidler oluşturmak için DNA'nın birçok kopyasına ihtiyaç duyulur. Bazı diğer durumlarda ise, DNA parçası faydalı bir proteini kopyaladığı için, bakteriler bu proteinin elde edilmesi için fabrika olarak kullanılır. Örnek vermek gerekirse, diyabet hastaları tarafından kullanılan insülini elde etmek için, insülin geni E. coli bakterilerinde ifade edilmektedir.

DNA'nın klonlanmasının adımları

DNA birçok farklı amaç için klonlanır. Örnek olarak, DNA'nın klonlanmasının insan insülini gibi bir proteinin bakterilerdeki sentezinde nasıl kullanıldığını inceleyelim. Sürecin temek adımları şu şekildedir:
  1. Plazmidi kas ve geni "yapıştır". Bu süreç, DNA'yı kesen restriksiyon enzimleri ve DNA'yı birleştiren DNA ligaz enzimleri aracılığı ile yapılır.
  2. Plazmidi bakteriye dönüştür. Antibiyotik seçimi ile plazmidi alan bakterileri belirle.
  3. Plazmidi taşıyan bakterileri yetiştir ve onları protein için "fabrikalar" olara kullan. Proteini bakterilerden topla ve saflaştır.
Adımları biraz daha yakından incelemeye ne dersiniz?

1. DNA'yı kesme ve yapıştırma

Farklı kaynakları olan DNA parçaları nasıl birleştirilir? Yaygın olarak kullanılan bir yöntemde, iki farklı enzim rol alır: restriksiyon enzimleri ve DNA.
Restriksiyon enzimleri, belirli bir DNA dizisini algılayarak, DNA'yı bu bölgeye yakın bir yerden iki parçaya ayırabilen DNA kesici enzimlerdir. Birçok restriksiyon enzimi, kısa, tek iplikli uzantıları olan kesi uçları oluşturur. İki molekülün uzantıları eşleşiyorsa, bazları eşleşir ve bir araya gelirler. Ancak parçalanmamış bir DNA molekülü elde edilmesi için birleşmeleri ancak DNA ligaz tarafından bileştirilmeleri, başka bir deyişle, DNA omurgasındaki boşlukların kapatılması ile mümkündür.
Klonlamadaki amaç, insan insülini gibi hedef bir geni bir plazmide yerleştirmektir. Dikkatlice seçilmiş bir restriksiyon enzimi ile:
  • Tek bir kesi bölgesi olan plazmid ile
  • Her iki ucuna yakın kesi bölgeleri olan hedef gen fragmanı bir araya getirilir.
Sonrasında, fragmanlar, geni içeren rekombinant bir plazmid elde edilmesi için DNA ligaz yardımı ile birleştirilir.
Restriksiyon sindirimi ve ligasyonu gösteren basit bir şekilde tasvir eden şema.
Dairesel bakteriyel bir plazmid ve bir hedef gen ile işe başlarız. Hedef genin iki ucunda da restriksiyon bölgeleri ya da belirli bir restriksiyon enzimi tarafından algılanan DNA dizileri bulunur. Plazmidin içine de, aynı enzim tarafından algılanacak ve bakterilerdeki ifadeyi sürdüren bir promotörden sonra yer alan bir restriksiyon bölgesi bulunmaktadır.
Restriksiyon enzimi hem plazmidi hem de hedef geni ayrı ayrı sindirir. Fragmanlar saflaştırılır ve birleştirilir. Eşleşen "yapışkan uçları" ya da tek iplikli DNA'dan oluşan uzantıları vardır ve bu sayede birbirlerine yapışırlar.
DNA ligaz enzimi eşleşen uçları bulunan fragmanları birleştirip, tek bir tane parçalanmamış DNA molekülü oluşturur. Bunun sonucunda da hedef geni içeren rekombinant bir plazmid üretilmiş olur.

2. Bakteriyel transformasyon ve seçilim

Plazmidler ve diğer DNA'lar, E. coli gibi laboratuvarlarda kullanılan zararsız bakterilerin bulunduğu ortama, transformasyon adı verilen bir işlem ile eklenebilir. Transformasyon sırasında, özel olarak hazırlanmış bakteri hücrelerine yüksek sıcaklıklar gibi bir şok verilir ve bakteriler bu şekilde, kendilerine yabancı olan DNA'yı kabul ederler.
Ligasyon ile elde edilen, istenilen plazmidlerin bir karışımı, yan ürün olan plazmidler ve doğrusal DNA parçaları olan DNA, bakterilerin bulunduğu ortama eklenir. Bakterilere bir ısı şoku verilir, bu sayede transformasyon ile DNA almaya daha hazır hale gelirler. Ancak plazmidi başarı ile alan bakterilerin yalnızca küçük bir yüzde olduğunu bilmelisiniz.
Plazmidler tipik olarak antibiyotiğe dayanıklı bir gen içerirler, bu gen, bakterilerin içinde antibiyotik bulunan bir ortamda hayatta kalmalarını sağlar. Bu şekilde, plazmidi almış olan bakteriler, antibiyotik içeren besin kaplarında seçilebilirler. Plazmidi olmayan bakteriler ölürken, plazmidi olan bakteriler hayatta kalıp üreyebililer. Hayatta kalan her bir bakteri küçük bir noktaya benzeyen ve koloni olarak adlandırılan bir grubun oluşmasını sağlar. Bu grupta bulunan bakterilerin hepsi aynı plazmide sahiptir.
Sol panel: Antibiyotiğe dayanıklı bir gen içeren plazmide ait bir şema.
Sağ panel: transformasyona tabi tutulan bakterilerin tamamı antibiyotik içeren bir kaba konur. Plazmidi olmayan bakteriler antibiyotik sebebi ile ölürken, plazmide sahip olan bakteriler bir koloni ya da hepsi aynı plazmide sahip klonlanmış bakteriler üretirler. Bir koloni tipik olarak küçük beyazımsı bir nokta gibi görünür.
Kolonilerin hepsi doğru plazmide sahip değillerdir. Bunun sebebi ligasyon sırasında, DNA parçalarının her zaman, istenilen şekilde "yapıştırılmamasıdır". Bundan dolayı farklı kolonilerden gelen bakterilerden DNA örnekleri alıp, doğru plazmide sahip olup olmadıklarını belirlememiz gerekir. Restriksiyon enzimi sindirimive PCR gibi yöntemler, plazmidleri kontrol etmek için kullanılan yaygın yöntemler arasındadır.

3. Protein üretimi

Doğru plazmide sahip olan bakteri kolonisi bulunduğunda, bu plazmidi taşıyan bakterilerden büyük bir kültür yetiştirilebilir. Sonrasında bakterilere, hedef proteini almaları talimatını veren kimyasal bir sinyal verilir.
Bakteriler minyatür "fabrikalar" gibi davranarak proteini üretmeye başlarlar. Örnek olarak, plazmid eğer insan insülin genini içeriyor olsaydı, bakteriler genin transkripsiyonunu gerçekleştirip, mRNA'nın translasyonu sonucu bir sürü insan insülin proteini üretirlerdi.
Seçilen koloni büyük bir kültür (örneğin 1 litrelik bir kapta) olarak yetiştirilir. Büyük kültürdeki bakteriler, plazmidlerinde bulunan geni ifade etmeleri için indüklenirler, genin mRNA'ya transkripsiyonu, mRNA'nın da proteine translasyonu gerçekleşir. Genin kodladığı protein bakterilerin içinde birikmeye başlar.
Protein üretildikten sonra bakteri hücreleri yarılarak proteini serbest bırakırlar. Bakterilerin etrafında hedef protein (ör: insülin) dışında dolaşmakta olan farklı protein ve makromoleküller bulunmaktadır. Bu sebeple, hedef proteinin saflaştırılması yani biyokimyasal tekniklerle diğer hücre bileşenlerinden ayrılması gerekir. Saflaştırılmış protein deneyler için kullanılabilir ya da insülin örneğinde olduğu gibi hastalara verilebilir.

DNA'nın klonlanmasının kullanıldığı alanlar

Klonlama teknikleri kullanılarak elde edilen DNA molekülleri, moleküler biyolojide birçok farklı amaç için kullanılıyor. Örneklerden oluşan kısa bir listeyi aşağıda bulabilirsiniz.
  • Biyofarmasötik. DNA'nın klonlanması sayesinde, yukarıda bahsettiğimiz insülin örneğinde olduğu gibi, biyomedikal uygulamaları olan insan proteinleri elde edilebilir. Rekombinant proteinlere verilebilecek diğer örnekler arasında, hormonu sentezleyemeyen insanlara verilen insan büyüme hormonu ve inme tedavisi ile kan pıhtılarının engellenmesinde kullanılan doku plazminojen aktivatör (tPA) bulunur. Buna benzer rekombinant proteinlerde çoğu zaman bakterilerde üretilir.
  • Gen terapisi. Bazı genetik bozukluklarda, hastalar belirli bir genin fonksiyonel formuna sahip değillerdir. Gen terapisi ile hastanın vücut hücrelerine genin normal bir kopyası aktarılır. Örneğin, kistik fibröz hastalığında işlevsel olmayan bir genin normal versiyonu, DNA'nın klonlanması ile üretilen plazmidlere yerleştirilir. Plazmidler, kistik fibröz hastalarının akciğerlerine iletildiğinde, akciğer fonksiyonlarındaki bozulma hızının azaldığı görülmüştür2.
  • Gen analizi. Basit araştırma laboratuvarlarında, biyologlar DNA'yı klonlayarak, bir organizmadaki normal genlerin nasıl işlediğini anlamalarına yardımcı olacak yapay, rekombinant gen versiyonları elde ederler.
Bunlar, DNA'nın klonlanmasının biyolojideki güncel kullanımlarına dair örneklerden sadece birkaçı. DNA klonlanması, birçok moleküler biyoloji uygulamasında yer edinmiş, oldukça yaygın bir tekniktir.

Tartışmaya katılmak ister misiniz?

Giriş Yap
Henüz gönderi yok.
İngilizce biliyor musunuz? Khan Academy'nin İngilizce sitesinde neler olduğunu görmek için buraya tıklayın.