Ana içerik

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Tepkimesi) - PCR

DNA'daki belirli hedef böleyi büyütmek ya da kopyalamak için kullanılan bir teknik.

Önemli noktalar:

Polimeraz Zincir Tepkimesi ya da PCR, belirli bir DNA bölgesinin canlı olmayan bir ortamda, bir başka deyişle bir organizmanın içi yerine bir deney tüpünün içinde, çok sayıda kopyasının oluşturulması yöntemine verilen isimdir.
PCR, ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz olan Taq polimeraz sayesinde gerçekleşir ve özellikle ilgili DNA bölgesi için tasarlanmış DNA primerlerine ihtiyaç duyar.
PCR' da, tepkime bir dizi sıcaklık değişimleri boyunca tekrar tekrar döngülenir ve bu da hedef bölgenin birçok kopyasının üretilmesini sağlar.
PCR, birçok araştırma ve pratik uygulamaya sahiptir. PCR rutin bir şekilde, DNA'nın klonlanmasında, tıbbi teşhislerde ve adli DNA analizlerinde kullanılmaktadır.

PCR nedir?

Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), belirli bir DNA bölgesinin çok sayıda kopyasını (milyonlarca hatta milyarlarca!) üretmek için kullanılan yaygın bir laboratuvar tekniğidir. Bu DNA bölgesi, deneyi yapan kişinin ilgilendiği her yer olabilir. Örneğin, bir araştırmacının işlevini anlamak istediği bir gen ya da adli tıp uzmanlarının olay yerini şüphelilerle eşleştirmek için kullandığı genetik işaretleyici olabilir.

PCR'ın tipik amacı hedef DNA bölgesinden, analiz etmeye ya da başka bir şekilde kullanmaya yetecek kadar üretmektir. Örneğin, PCR ile kopyalanan DNA, dizilemeye gönderilebilir, jel elektroforez ile görüntülenebilir ya da başka deneyler için plazmide klonlanabilir.

PCR, moleküler biyoloji araştırmalar, tıbbi teşhisler ve hatta ekolojinin bazı dallarını da içermekle birlikte biyoloji ve tıbbın birçok alanında kullanılmaktadır.

Taq polimeraz

Bir organizmadaki DNA replikasyonu gibi, PCR da var olan dizileri şablon olarak kullanarak yeni DNA dizileri oluşturan bir DNA polimeraz enzimine ihtiyaç duyar. PCR'da yaygın olarak kullanılan DNA polimeraz, izole edildiği ısıya dayanıklı bakterinin isminden türetilen (Thermus aquaticus) Taq polimeraz adıyla bilinir.

T. aquaticus, kaplıcalarda ve hidrotermal bacalarda yaşar. DNA polimeraz, ısıya çok dayanıklıdır ve en aktif olduğu sıcaklık

70 ° C

civarıdır (bir insanın veya E. coli DNA polimerazın işlevsiz olacağı bir sıcaklık). Bu ısı direnci, Taq polimerazı PCR için ideal kılar. Göreceğimiz gibi, PCR'da şablon DNA'yı denatüre etmek veya dizilerini ayırmak için tekrar tekrar yüksek sıcaklıklar kullanılır.

PCR primerleri

Diğer DNA polimerazlar gibi Taq polimeraz da sadece DNA sentezi için bir başlama noktası sağlayan kısa bir nükleotid dizisi
yani primer verilirse DNA üretebilir. Bir PCR tepkimesinde deneyi yapan kişi, kopyalanacak ya da çoğaltılacak DNA bölgesini kendi seçtiği primerler ile belirler.

PCR primerleri genellikle

20

nükleotit uzunluğundaki kısa, tek iplikli DNA parçalarıdır. Her PCR tepkimesinde iki primer kullanılır ve hedef bölgeyi kuşatmak için tasarlanmışlardır (kopyalanması gereken bölge). Yani, kopyalanacak bölgenin tam kenarlarından, şablon DNA'nın zıt dizilerine bağlanmalarını sağlayacak dizilere sahiptirler. Primerler, tamamlayıcı baz eşleşmesi ile şablona bağlanırlar.

Primerler şablona bağlandığında, polimeraz tarafından uzatılabilir ve aralarında kalan bölge kopyalanır.

PCR'ın adımları

Bir PCR tepkimesinin temel bileşenleri, Taq polimeraz, primerler, şablon DNA ve nükleotitler yani DNA yapı taşlarıdır. Bu bileşenler, enzimin ihtiyaç duyduğu kofaktörlerle birlikte bir tüpte bir araya getirilir ve DNA'nın sentezlenmesi için tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngülerinden geçirilir.

Temel adımlar şunlardır:

Denatürasyon ( $96 ° C$ ‍): DNA ipliklerini ayırmak veya denatüre etmek için tepkime, şiddetli bir şekilde ısıtılır. Bu adım, bir sonraki adım için tek sarmallı bir şablon sağlar.
Yeniden birleşme ( $55$ ‍ $-$ ‍ $65$ ‍ $° C$ ‍): Primerlerin tek iplikli şablon DNA üzerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanabilmeleri için tepkime soğutulur.
Uzatma ( $72 ° C$ ‍): Taq polimerazın primerleri uzatması ve yeni DNA zincirlerini sentezlemesi için tepkime sıcaklıkları arttırılır.

Bu döngü tipik bir PCR tepkimesinde,

25

-

35

defa tekrarlanır ve kopyalanan DNA bölgesinin uzunluğuna bağlı olarak genellikle

2

-

4

saat sürer. Eğer tepkime verimli olursa (işe yararsa), hedef bölge sadece bir ya da birkaç kopyadan milyarlarca kopya sayısına ulaşabilir.

Bunun nedeni, her seferinde şablon olarak yalnızca orijinal DNA'nın kullanılmamasıdır. Aksine, bir turda üretilen yeni DNA, bir sonraki DNA sentezi turunda şablon görevi görebilmektedir. Primerlerin birçok kopyası ve tepkimede serbestçe dolaşan birçok Taq polimeraz molekülü vardır, yani DNA moleküllerinin sayısı her döngüde yaklaşık olarak iki katına çıkabilir. Bu üstel büyüme modeli aşağıdaki görselde gösterilmektedir.

PCR sonuçlarını görselleştirmek için jel elektroforezinin kullanımı

Bir PCR tepkimesinin sonuçları genellikle jel elektroforezi kullanılarak görselleştirilir (görünür hale getirilir). Jel elektroforezi, DNA parçalarının bir elektrik akımı tarafından bir jel kalıbından çekildiği ve akımın DNA parçalarını boyutlarına göre ayırdığı bir tekniktir. PCR numunesindeki parçaların boyutunun belirlenebilmesi için genellikle bir standart veya DNA merdiveni eklenir.

Aynı uzunluktaki DNA parçaları, jel üzerinde bir "bant" oluşturur ve eğer jel bir DNA bağlayıcı boya ile boyanırsa bu bant gözle görülebilir. Örneğin,

400

baz çifti (bp) parça üreten bir PCR tepkimesi, bir jel üzerinde şöyle görünecektir:

Bir DNA bandı, hedef DNA bölgesinin yalnızca bir veya birkaç kopyasını değil, çok ama çok sayıda kopyasını içerir. DNA mikroskobik olduğundan, gözle görebilmemiz için çok sayıda kopyasının mevcut olması gerekir. Bu da PCR'ın neden önemli bir araç olduğunun temel sebeplerinden biridir: bir DNA dizisinin, DNA'nın o bölgesini görebileceğimiz veya üzerinde değişimler yapabileceğimiz kadar kopyasını üretir.

PCR uygulamaları

PCR kullanılarak, bir DNA dizisi milyonlarca ya da milyarlarca kez çoğaltılabilir ve böylelikle diğer teknikler ile analiz edilmeye yetecek kadar DNA kopyası üretilebilir. Örneğin, DNA jel elektroforezi ile görüntülenebilir, dizileme için gönderilebilir veya restriksiyon enzimleri ile sindirilebilir ve bir plazmide klonlanabilir.

Birçok araştırma laboratuvarında kullanılmakta olan PCR'ın ayrıca adli tıp, genetik test ve teşhis alanlarında pratik uygulamaları vardır. PCR örneğin, hastaların DNA'sındaki genetik bozukluklarla ilişkili genleri (ya da doğum öncesi test durumunda fetal DNA'dan) çoğaltmak için kullanılır. PCR ayrıca bir hastanın vücudunda bir bakteri veya DNA virüsünün bulunup bulunmadığını test etmek için de kullanılabilir: Eğer hastada patojen mevcutsa, DNA'sının bölgelerini bir kan veya doku örneğinden çoğaltmak mümkün olabilir.

Örnek problem: PCR'ın adli tıptaki rolü

Bir adli tıp laboratuvarında çalıştığınızı varsayalım. Bir olay yerinde bırakılmış bir saç telinden ve üç olası şüpheliden DNA örneği teslim aldınız. Göreviniz, belirli bir genetik işaretleyiciyi incelemek ve üç şüpheliden herhangi birinin bu işaretleyici yönünden saç DNA'sıyla eşleşip eşleşmediğini anlamak.

İşaretleyici, iki alel veya versiyon halinde gelir. Biri tek bir tekrar içerir (aşağıdaki kahverengi bölge), diğeri ise tekrarın iki kopyasını içerir. Tekrar bölgesini kuşatan primerlere sahip bir PCR tepkimesinde, ilk alel

200

bp

'lik bir DNA parçası üretirken ikincisi

300

bp

'lik bir DNA parçası üretiyor:

Dört DNA örneği üzerine PCR uyguluyorsunuz ve sonuçları aşağıda gösterildiği gibi jel elektroforezi ile görselleştiriyorsunuz:

Hangi şüphelinin DNA'sı bu işaretleyicide olay yerindeki DNA ile eşleşiyor

İnsanlar diploit, yani DNA'larının çoğunun iki kopyasına sahiptirler. Bu nedenle, DNA örneklerinin her birinde incelediğimiz işaretleyicinin iki kopyası olacaktır.

Eğer bir kişi işaretleyicinin iki farklı aleline sahipse (heterozigot ise) PCR sırasında iki farklı boyutta (

200

bp ve

300

bp) bant çoğaltılacaktır. Bunlar, jelde

200

bp ve

300

bp konumlarında DNA bantları olarak görünecektir.

Bir kişi aynı alelin iki kopyasına sahipse (homozigot ise), PCR sırasında yalnızca bir bant çoğaltılacaktır. Eğer kişi

200

bp aleline homozigotsa, jel üzerinde yalnızca

200

bp'lik bir bant görünecektir. Benzer şekilde, eğer kişi

300

bp aleline homozigotsa jelde sadece

300

bp'lik bir bant görünecektir.

DNA numunelerinin işaretleyici genotipleri şunlardır:

Olay yerinden alınan DNA: homozigot $200$ ‍ bp alel
Şüpheli $1$ ‍: homozigot $300$ ‍ bp alel
Şüpheli $2$ ‍: heterozigot
Şüpheli $3$ ‍: homozigot $200$ ‍ bp alel

Hem olay yerinden alınan DNA örneği hem de şüpheli

3

'ten alınan DNA örneği, işaretleyicinin

200

bp versiyonuna homozigottur. Yani, bu iki örnek bu işaretleyici için eşleşmektedir.

PCR ve adli tıp hakkında daha fazla bilgi edinmek ister misiniz?

Bir olay yerinden alınan gerçek adli DNA testlerinde, teknisyenler kavramsal olarak yukarıdaki örnektekine benzer bir analiz yapacaktır. Fakat olay yeri DNA'sı ile şüphelilerin DNA'sı arasında, örnekteki gibi yalnızca tek işaretleyici değil, birkaç sayıda farklı işaretleyici karşılaştırılacaktır.

Ayrıca, tipik bir adli analizde kullanılan işaretleyiciler yalnızca iki farklı biçimde değillerdir. Aksine, oldukça çokbiçimlidirler (Polimorfizm, poli= çok morfizmos = form). Yani, uzunlukları açısından küçük farklara sahip birçok alel ile gelirler.

Kısa ardışık tekrarlar (STR'ler) olarak adlandırılan adli tıpta en sık kullanılan işaretleyici türü, aynı kısa nükleotit dizisinin (tipik olarak

2

ila

5

nükleotid uzunluğunda) tekrar eden birçok kopyasından oluşur. Bir STR'nin bir aleli

20

tekrara sahipken, bir başkası

18

ve bir diğeri de sadece

10

tekrara sahip olabilir.

Adli tıpla uğraşan bilim insanları, her biri birçok alel biçiminde gelen birçok işaretleyiciyi inceleyerek, bir DNA örneğinden benzersiz bir genetik "parmak izi" oluşturabilirler.

13

işaretleyici kullanan tipik bir STR analizinde, yanlış pozitif sonuç (aynı DNA "parmak izine" sahip iki kişi olması) olasılığı

10

milyarda

^{1}

1

'den azdır!

Her ne kadar DNA kanıtlarının suçları ispat etmek için kullanıldığını düşünsek de, DNA kanıtları haksız yere suçlanan kişilerin (bazıları yıllarca hapiste yatmış olanlar da dahil) temize çıkarılmasında çok önemli bir rol oynamıştır. Adli tıp analizi aynı zamanda babalık testleri ve afet yerlerindeki insan kalıntılarını tespit etmek için de kullanılmaktadır.

Açıklama:

Bu makalenin uyarlandığı kaynak: "The polymerase chain reaction," CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0).

Uyarlanmış makale CC-BY-NC-SA 4.0 lisansıyla lisanslanmıştır.

Alıntı yapılan çalışmalar:

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. ve Jackson, R. B. (2011). Forensic evidence and genetic profiles. (10. baskı, sayfa 430-431). San Francisco, CA: Pearson.

Referanslar:

Kimball, J. W. (3 Mayıs 2014). PCR. Kimball's biology pages. Alıntı yapılan kaynak: http://www.biology-pages.info/P/PCR.html.

OpenStax College, Biology. (23 Mart 2016). Biotechnology. OpenStax CNX. Alıntı yapılan kaynak: http://cnx.org/contents/GFy_h8cu@10,8:exg4e4AU@7/Biotechnology.

Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J., and Dickey, J. L. (2012). DNA profiling. Campbell biology: Concepts & connections (7. baskı, sayfa 242-246).

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V. ve Jackson, R. B. (2011). Amplifying DNA: The polymerase chain reaction (PCR) and its use in DNA cloning. (10. baskı, sayfa 414-416). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Biotechnology and forensic science - advanced. In CK-12. Alıntı yapılan kaynak: http://www.ck12.org/biology/Biotechnology-and-Forensic-Science/lesson/Biotechnology-and-Forensic-Science-Advanced-BIO-ADV/.