Ana içerik
DNA dizileme
Nükleotit bazlarının (A, T, C ve G) bir DNA parçasındaki dizilimleri nasıl belirlenir?
Önemli noktalar:
- DNA dizilimi, bir DNA parçasındaki nükleotid dizisini (A, T, C ve G) belirleme işlemidir.
- Sanger diziliminde, hedef DNA birçok defa kopyalanır ve farklı uzunlukları olan fragmanlar elde edilir. Floresan "zincir terminatör" nükleotidleri fragmanların uçlarını işaretler ve dizinin tanımlanmasını mümkün kılar.
- Yeni nesil dizilim yöntemleri, DNA diziliminin hızını arttırıp, maliyetini düşüren yeni ve büyük ölçekli yaklaşımlardır.
Dizilim nedir?
Genomların diziliminin yapıldığını duymuşsunuzdur. Örneğin insan genomu 2003 yılında, çok uzun süren uluslararası çalışmalar sonucunda tamamlandı. Peki genomun yada ufak bir DNA fragmanının dizilimin yapılması ne anlama gelir?
DNA dizilimi, bir DNA parçasındaki nükleotid bazlarının (A, T, C ve G) diziliminin belirlenmesidir. Günümüzde, doğu ekipman ve malzemeler ile, kısa bir DNA parçasının diziliminin yapılması nispeten basit bir işlemdir.
Genomun tamamının (bir organizmanın DNA'sının tamamının) diziliminin yapılması ise hala karmaşı bir görevdir. Genom DNA'sının küçük parçalara ayrılması, bu parçaların dizilimlerinin yapılması ve dizilimleri tek ve uzun bir dizi olarak birleştirilmesi gerekir. Ancak geçtiğimiz yirmi yılda geliştirilen yeni yöntemler satesinde, genomun diziliminin yapılması, İnsan Genomu Projesi zamanındakine göre çok daha hızlı ve çok da az maliyetli bir işlem halini almıştır
Bu makalede, DNA'nın diziliminin yapılmasında kullanılan yöntemleri inceleyeceğiz. İyice geliştirilmiş bir yöntem olan Sanger diziliminin yanı sıra, büyük ölçekli dizilimlerin hızını arttıran ve maliyetini düşüren yeni ("yeni nesil") yöntemleri de ele alacağız.
Sanger dizilimi: Zincir terminasyon yöntemi
En çok
Sanger dizilimi, İnsan Genomu Projesi'nde birçok nispeten küçük insan DNA'sı parçalarının diziliminin belirlenmesi için kullanıldı. Bu fragmanlar
Genomların dizilimi, daha hızlı ve daha az maliyetli yöntemlerle yapılıyor olsa da, Sanger dizilimi halen, DNA'nın klonlanmasında kullanılan fragmanlar ya da polimeraz zincir tepkimesinde (PCR) elde edilen, tekil DNA parçaları söz konusu olduğunda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
Sanger diziliminin malzemeleri
Sanger dizilimi, hedef DNA bölgesinin birçok kopyasını yapar. İhtiyaç duyulan malzemeler bir organizmanın DNA replikasyonu ya da DNA'nın canlı olmayan ortamda kopyalanmasını sağlayan polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için ihtiyaç duyulanlara benzerdir.
- Bir DNA polimeraz enzimi
- Kısa ve tek iplikli bir DNA parçası olan ve şablon DNA'ya bağlanarak polimeraz için "başlatıcı" olü üstlenen bir primer
- Dört DNA nükleotidi (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- Dizilimi yapılacak şablon DNA
Ancak, bir Sanger dizilimi tepkimesinin bunların yanında eşsiz bir malzemeye daha ihtiyacı vardır:
- Dört nükleotidin her birinin dideoksi ya da zincir sonlandıran, her biri farklı renk bir boya ile işaretlenmiş versiyonları: ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP
Dideoksi nükleotidler, normal yani deoksi nükleotidlere benzerler ancak aralarında önemli bir fark vardır: şeker halkalarındaki 3' karbonlarında bir hidroksil grupları eksiktir. Normal nükleotidlerde, 3' hidroksil grubu, bir "kanca" görevi görerek, yeni bir nükleotidin zincire eklenmesini mümkün kılar.
Bir dideoksi nükleotid zincire eklendiğinde, uygun durumda hidroksil olmadığından, ilave nükleotidler zincire eklenemez. Zincir, taşıdığı baza (A, C, T ya da G) bağlı olarak farklı bir renk boya ile işaretlenmiş olan dideoksi nükleotid ile sonlanır.
Sanger diziliminin yöntemi
Dizilimi yapılacak DNA numunesi, bir primer, DNA polimeraz ve DNA nükleotidleri (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP) ile bir tüpte bir araya getirilir. Dört adet boya ile işaretli zincir sonlandıran dideoksi nükleotidler de tüpe eklenir ancak miktarları diğer nükleotidlere göre çok daha azdır.
Karışım öncelikle, şablon DNA'yı denatüre etmek (sarmalları birbirinden ayırmak) için ısıtılır sonrasında ise, primerin tek iplikli şablona bağlanabilmesi için soğutulur. Primer bağlandığında, sıcaklık yeniden arttırılır ve böylelikle DNA polimeraz, primerden başlayarak yeni DNA'nın sentezini gerçekleştirebilir. DNA polimeraz, normal bir nükleotid yerine bir dideoksi nükleotid ekleyene kadar zincire nükleotid eklemeyi sürdürür. Bu noktada, daha fazla nükleotid eklenemez ve iplik bir dideoksi nükleotid ile sonlanır.
Bu süreç birçok defa tekrarlanır. Döngü tamamlandığında, dideoksi nükleotidlerin, tepkimelerin en az birinde, hedef DNA'nın her bir pozisyonuna eklenmiş olması garantidir. Bu da, tüpün içinde farklı uzunluklarda, orijinal DNA'daki nükleotid pozisyonlarının her birinde sonlanan fragmanlar olacağı anlamına gelir (aşağıdaki şekli inceleyin). Fragmanların uçları, son nükleotidin hangisi olduğunu belirtecek renkte boyalar ile işaretlenir.
Tepkime tamamlandıktan sonra, fragmanlar, kapiler jel elektroforezi adı verilen bir işlem ile, uzun, ince ve jel bir matris içeren bir tüpten geçirilir. Kısa fragmanlar jelin gözenekleri içinde hızla hareket ederken, uzun fragmanlar daha yavaş hareket ederler. Her fragman, tüpün sonunda yer alan "bitiş çizgisini" geçtiğinde, bir lazer ile aydınlatılır ve böylelikle boyanın algılanması sağlanır.
Primerden sonra tek bir nükleotid ile biten en kısa fragman bitiş çizgisini ilk olarak geçer. Onu primerden sonra iki nükleotid ile biten sıradaki en kısa fragman izler ve bu, bu şekilde devam eder. Sonuç olarak, detektör tarafından sırasıyla belirlenen boya renkleri sayesinde, orijinal DNA parçasının dizilimi her defasında bir nükleotid olacak şekilde bir araya getirilmiş olur. Detektör tarafından kayıt altına alınan veri, aşağıdaki kromatogram da gösterildiği gibi, floresan şiddetindeki tepe noktalarından oluşan seriler içerir. DNA dizilimi kromatogramdaki tepe noktalarına göre okunur.
Kullanım ve sınırlamalar
Sanger dizilimi, nispeten uzun (en fazla
Yine de, Sanger diziliminin maliyetli ve bir genomun tamamı ya da metagenom (mikrop aleminin toplu genonmu) gibi çok daha büyük ölçekli projeler için verimsizdir. Bunlar gibi görevlerde, daha hızlı ve daha az maliyetli olan yeni büyük ölçekli dizilim teknikleri kullanılır.
Yeni nesil dizilim
Bu ismi duyunca aklınıza Star Trek gelmiş olabilir ancak bu yeni yöntemler gerçekten de bu şekilde adlandırılıyorlar. En yeni DNA dizilim teknolojilerinden, toplu olarak yeni nesil dizilim olarak bahsedilmekte.
Farklı teknolojiler kullanan birçok farklı yeni nesil dizilim yöntemi bulunuyor. Size burada, onları Sanger diziliminden farklı kılan ortak özelliklerinden bahsedeceğiz.
- Paralelliği yüksek: birçok dizilim tepkimesi aynı anda gerçekleşir.
- Mikro ölçek: tepkimeler küçük ve birçoğu aynı anda bir çip üzerinde gerçekleştirilebilir.
- Hızlı: tepkimeler paralel bir şekilde sürdürüldüğü için sonuçlar çok daha hızlı elde edilir.
- Düşük maliyetli: bir genomun diziliminin yapılması, Sanger dizilimine göre çok daha düşük maliyetlidir.
- Daha kısa uzunluklar: Tipik olarak
Yeni nesil dizilim, kavramsal olarak, çok sayıda küçük Sanger dizilim tepkimesinin paralel olarak sürdürülmesi olarak düşünülebilir. Bu paralelleşme ve küçük ölçek sayesinde, büyük DNA'ların dizilimleri, Sanger dizilimine göre, çok daha hızlı ve düşük maliyetler ile yapılabilmektedir. Örneğin 2001 yılında, insan genomunun dizilimin maliyeti
Dizilimin hızlı ve düşük maliyetli bir şekilde yapılabilmesi neden önemlidir? Genomların diziliminin rutin bir şekilde yapılabilmesi, biyolojik araştırmalar ve biyomedikal uygulamalar açısından yeni olanaklar doğurur. Örneğin düşük maliyetli dizilim, tıbbın kişiselleştirilmesine doğru atılan bir adımdır, bu tedavilerin, kişilerin genomlarındaki gen varyantlarına bağlı olarak, ihtiyaçları doğrultusunda düzenlenebilmesini sağlayacaktır.
Tartışmaya katılmak ister misiniz?
Henüz gönderi yok.