Ana içerik
Jel Elektroforezi
DNA parçalarını ve diğer makromolekülleri boyut ve yüklerine göre ayırmak için kullanılan bir teknik.
Önemli noktalar:
- Jel elektroforezi, DNA parçalarını boyutlarına göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir.
- DNA numuneleri jelin bir ucunda bulunan boşluklara (girintilere) doldurulur ve jel içinde çekilmeleri için bir elektrik akımı uygulanır.
- DNA fragmanları negatif yüklü oldukları için pozitif elektroda doğru ilerlerler. DNA fragmanlarının hepsi kütle başına aynı miktada yük barındırdığı için, küçük fragmanlar jel içerisinde büyüklere göre daha hızlı ilerlerler.
- Jel, DNA bağlayıcı bir boya ile renklendirildiğinde, DNA fragmanlarını, her biri aynı boyutta olan fragmanlar içeren grupları temsil eden bantlar olarak görebiliriz.
Giriş
Hedef bir DNA bölgesinden birçok kopya elde etmek için bir PCR tepkimesi gerçekleştirdiğinizi varsayalım. Ya da belki de, DNA'nın klonlanması süreci ile, bir geni, dairesel bir plazmide "yapıştırmayı" deniyorsunuzdur.
Şimdi de, PCR'ın başarılı olup olmadığını ya da plazmidin doğru geni içerip içermediğini görmek istiyorsunuz. DNA fragmanlarını doğrudan gözlemleyebilrmek için hangi yöntemi kullanırsınız?
Jel Elektroforezi
Jel elektroforezi, DNA fragmanlarını ya da RNA ve proteinler gibi diğer makromolekülleri, boyutlarına ya da yüklerine göre ayırmak için kullanılan bir yöntemdir. Elektroforezi, ilgilenilen molekülleri içeren bir jelin içinden elektrik akımı geçirilmesi ile yapılır. Moleküller, jel içinde boyutları ve yüklerine bağlı olarak farklı yönlerde ve farklı hızlarda ilerlerler. Bu sayede de birbirlerinden ayrılabilirler.
Tüm DNA moleküllerinin kütle başına yükü aynıdır. Bu sebeple de, DNA fragmanlarının elektroforezisi, fragmanları yalnızca boyutlarına göre ayırır. Elektroforezi ile, bir DNA numunesinde, kaç farklı DNA fragmanı bulunduğunu ve fragmanların birbirlerine göre ne kadar büyük olduklarını öğrenebiliriz. Ayrıca, boyutları bilinen fragmanlarından oluşan bir standart kullanılarak bir DNA parçasının mutlak boyutunu da belirlemek mümkündür.
Jel nedir?
Adından da anlaşılacağı gibi, jel elektroforezide jeller kullanılır. Jeli, jöleye benzeyen bir madde olarak düşünebilirsiniz. DNA ayrımı için kullanılan jeller genellikle bir polisakkait olan ve kuru, pudra halinde tanecikler olarak buluna agarozdan yapılır. Agaroz, bir tampon ya da içinde bazı tuzlar bulunan su içimde ısıtıldığında, katı ve süngerimsi bir jele dönüşür. Jel, moleküler seviyede, hidrojen bağları ile bir arada tutulan ve ufak gözenekler oluşturan agaroz moleküllerinden oluşan bir jel matristir.
Jelin bir ucunda, cebe benzeyen ve kuyu olarak adlandırılan girintiler bulunur ve DNA numuneleri buralara yerleştirilir:
DNA numunleri eklenmeden, jelin, bir jel kutusuna yerleştirilmesi gerekir. Kutunun bir ucuna pozitif bir elektrot, diğer ucuna ise negatif bir elektrot bağlanır. Kutunun kendisi yani içine jel yeleştirilen kısmı ise, elektrik akımını geçiren, içinde tuz bulunan bir tampon çözelti ile doldurulur. Bunu muhteşem sanat kabiliyetim sayesinde yukarıdaki görselde göremeseniz de, tampon, kutuyu, jelin üst seviyesine gelecek seviyede doldurur.
Jelin, kuyuların bulunduğu ucu negatif elektroda doğru konumlanır. Kuyuların bulunmadığı ve DNA fragmanlarının ona doğru hareket edeceği ucu ise pozitif elektroda doğru konumlanır.
DNA fragmanları jel içerisinde nasıl hareket ederler?
Jel kutuya konduğunda, her bir PCR tepkimesi ya da restriksiyon sindirimi gerçekleşmiş plazmid gibi incelemek istediğimiz DNA fragmanları, kuyulardan birine dikkatlice aktarılır. Kuyulardan biri, uzunlukları bilinen DNA fragmanları içeren standart bir referans olan DNA merdiveni için ayrılmıştır. Ticari merdivenler, farklı boyut aralıklarına sahip olduklarından, elimizdeki fragmanların boyut aralıklarını kapsayabilecek, iyi bir "kapsamı" olan merdivenlerden birini seçmemiz gerekir.
Sonrasında, kutuya güç verilir ve jelin içerisinden elektrik akımı geçmeye başlar. DNA molekülleri, şeker-fosfat omurgaları sebebiyle negatif yüklü oldukları için jel matrisinin içinde pozitif kutba doğru ilerlerler. Güç verildiğindeve akım jel içinden geçerken, jelin akış halinde olduğu söylenir.
Jel akış halindeyken, kısa DNA parçaları, jel matrisinin gözenekleri arasından, uzun olanlara göre daha hızlı bir şekilde ilerlerler. Jel bir süre aktıktan sonra, en kısa DNA parçaları, jelin pozitif ucuna yakın bir yerdeyken, en uzun DNA parçaları, kuyulara yakın bir yerde bulunurlar. DNA'nın çok kısa parçaları, jelin çok uzun süre akış halinde bırakılması söz konusu olursa, jelin diğer ucundan dışarı çıkabilirler. Bu arada, bu hatayı sıklıkla yaptığımı itiraf edebilirim.
DNA fragmanlarının gözlemlenmesi
Fragmanlar ayrıldığında, jeli inceleyerek içerdiği bantların boyutlarını görebiliriz. Jel, DNA bağlayan bir boya ile renklendirildiğinde ve mor ötesi ışık altına konulduğunda, DNA fragmanları parlayarak, jel boyunca farklı konumlarda bulunan DNA'ları görmemize olanak sağlar.
Jel içinde, keskin hatları olan bir DNA "şeridi" bant olarak adlandırılır. Her bir bant, aynı konuma bir grup halinde ulaşmış olan aynı boyutlara sahip yüksek sayıda DNA fragmanı içerir. Tek bir DNA fragmanının ya da küçük bir DNA fragmanı grubunun, jel içerisinde kendi başına görülebilmesi mümkün değildir.
Numunedeki bantları, DNA merdiveni ile karşılaştırdığımızda, yaklaşık boyutlarını belirleyebiliriz. Örneğin, yukarıdaki jeldeki parlak bantın boyutu yaklaşık olarak
Konuyu ne kadar iyi anladığınızı test edin
Yukarıdaki jelde işaretlenmiş olan dört şerit bulunuyo. (Şeritler, DNA'nın kuyudan ayrıldıktan sonra izlediği koridor olarak tanımlanır.)
Yukarıdaki tanımalara uyan şerit hangisidir?
Tartışmaya katılmak ister misiniz?
Henüz gönderi yok.